《药物毒理学》
课程编号：1241532033
实验指导书
主撰人 王丽娟
审核人 李建颖
天津商业大学生物技术与食品科学学院
二〇一三年九月
前 言
1.实验总体目标
药物毒理学是一门研究药物对机体有害作用的科学，是一门实验性科学。通过实验观察机体在应用药物过程中出现的机体全身或局部病理学改变，甚至引起的不可逆或致死性作用；以及药物对机体有害作用的发生发展与转归、毒理机制及其危害因素。实验教学是药物毒理学教学的重要组成部分。它既可以强化和加深学生对基本理论和规律的认识，更重要的是可以通过实验课培养学生的科学思维，动手操作能力，独立分析问题和解决问题的能力。
⒉ 适用专业年级：药事管理、制药工程、生物工程
⒊ 先修课程：人体解剖生理学，药理学
⒋ 实验课时分配：10
实验项目
实验要求
实验类型
每组人数
实验学时
实验一 有机磷酸酯类农药中毒、解救及胆碱酯酶活性测定
必做
综合
7-9人
6
实验二 药物半数致死量(LD50)的测定
4
……………
⒌ 实验环境
需要计算机、打印机；实验室要保证一定的温度和湿度；室内要保证空气清新，定期消毒等。
⒍ 实验总体要求
实验前要进行课前预习；实验课除因病或必须请假的急事之外不得缺勤；因动物的原因，缺勤不予补课；课堂上要积极动手操作，认真记录；课后完成实验报告的书写；等。
⒎ 本实验的重点、难点及教学方法建议
药物毒理学实验的重点是要学生了解本学科是一门实验性学科，了解动物实验常用的基本操作方法，毒理学实验常用的检测及记录方法，等。难点是动物的动手操作。建议在实验条件允许的情况下，尽量放手让学生操作。
目 录
实验一 有机磷酸酯类农药中毒、解救及胆碱酯酶活性测定 ……………..… 1
实验二 药物急性毒性研究(LD50)的测定 ……………….. 5
附录 ……………….. 8
实验一 有机磷酸酯类农药中毒、解救
及胆碱酯酶活性测定
第一部分 敌百虫中毒及解救
一、实验目的
通过观察敌百虫中毒的症状及阿托品和解磷定的解救效果，了解有机磷酸酯类农药残留引起的不良后果及其处理方法。
二、实验内容
观察家兔敌百虫中毒前后、药物解救前后的表现，分析中毒的机制、药物解救的原理。
三、实验要求
集中授课形式。
四、实验准备
有机磷酸酯类中毒的途径、机制及表现，阿托品与解磷定解救的机制和效果等知识。
五、实验原理、方法和手段
有机磷酸酯类为常用的农药，它们脂溶性高，接触后可以通过任何途径吸收并引起毒性反应。有机磷酸酯类通过抑制胆碱酯酶活性，使乙酰胆碱在体内堆积，产生中毒症状。抗胆碱药阿托品能解除有机磷酸酯类中毒的M样症状；而解磷定可复活胆碱酯酶，恢复其水解乙酰胆碱的能力，对M及N样症状均有效，以对骨骼肌震颤的解除作用产生最快、最明显。两药合用可提高解毒效果。
六、实验条件
1动物 家兔2只，体重2.5 kg～3.0kg，雌雄均可。
2药物及药品 5%敌百虫，0.1%硫酸阿托品，2.5%解磷定，7%柠檬酸钠。
3器材 注射器（20mL 1支、10mL 2支、5mL 1支、2mL2支、），测瞳尺（游标卡尺），刀片，采血皿（3个），头夹，棉球等。
七、实验步骤
1 取家兔两只，称重，分别观察下列各项指标：活动情况，呼吸（频率、有无呼吸困难、呼吸道有无分泌物等），瞳孔大小，唾液分泌，大小便，肌张力及肌震颤。
2 将家兔耳静脉用酒精棉球擦拭，当充血明显时，耳静脉采血约0.5～1.0mL（注射器要事先用抗凝剂润洗，防止凝血）。采血后伤口用干棉球按压止血。按此法，从甲、乙两兔耳静脉各采血一份，以便测正常时胆碱酯酶活性。
3 甲、乙两兔分别用另一耳缘静脉注射5%敌百虫1.5 mL·kg-1或75mg·kg-1，然后按上述指标观察中毒症状（大约在给药后10～15min内开始出现中毒症状），按表1记录之。待兔中毒症状明显后，依上法再次取血0.5 mL（即中毒后的血样品）。然后，甲兔立即耳缘静脉注射阿托品（1.0 mL·kg-1），乙兔立即耳缘静脉注射解磷定（4.0 mL·kg-1）,观察甲乙两兔的症状有何变化,记录之。然后再按上述方法采血0.5 mL（即解救后的血样品）。
4 注射阿托品解救后的家兔，采血后按4.0 mL·kg-1用耳静脉注射解磷定，以防止死亡。
5 将实验结果填入表1内。
表1 结 果 记 录
药物
或药物
剂量
/mL·kg-1
一般
活动
呼吸
/次·min-1
瞳孔
/mm
唾液
大小便
肌张力
肌震颤
给药前
敌百虫
阿托品
解磷定
第二部分 胆碱酯酶活性测定（Hestrin）
学习胆碱酯酶活性的测定方法，观察中毒前后及用不同药后胆碱酯酶活性的变化。
分光光度法测定血浆中胆碱酯酶活性的方法及其操作步骤。
血浆胆碱酯酶活性与有机磷酸酯类中毒程度之间的关系。
血中胆碱酯酶能催化乙酰胆碱水解产生乙酸和胆碱。在一定的温度、pH值和时间条件下，水解乙酰胆碱的量和胆碱酯酶活性成正比。因此，在一定量的血液中，加入一定量的乙酰胆碱反应一定时间，通过测定剩余的乙酰胆碱量，即可计算出水解的乙酰胆碱量，从而推算出胆碱酯酶的活力。
乙酰胆碱的呈色反应：乙酰胆碱可与羟胺作用生成乙酰羟肟酸，后者在酸性条件下与三价铁离子形成褐色的羟肟酸铁络合物，其颜色的深浅可反映乙酰胆碱含量的多少。反应过程如下：
1 盐酸羟胺与氢氧化钠作用释放出游离羟胺。
NH2OH•HCl+NaOH→NH2OH+NaCl+H2O
2 剩余乙酰胆碱与游离羟胺作用，生成羟肟酸化合物。
（CH3）3≡N–（CH2）2OCOCH3+NH2OH→CH3CONHOH+（CH3）≡N–（CH2）2OH
3 羟肟酸化合物在酸性环境中与三氯化铁生成褐色的复合物(羟肟酸铁络合物)，pH值1.0～1.5。
FeCl3+3CH3CONHOH→(CH3CONHO)3–Fe+3HCl
(红棕色)
1 标本 中毒前、中毒后、药物解救后的血样。
2 试剂及其配制
（1）0.007M氯化乙酰胆碱 取适量Ach，用蒸馏水或pH=4的盐酸配成2.54%的溶液，冰箱保存。用前以蒸馏水20倍稀释成0.007M的溶液。
（2）1M盐酸羟胺（NH2OH•HCl） 取25g盐酸羟胺，加蒸馏水至359mL配成1M溶液备用。一般可室温保存。如室温过高（30℃以上）可冰箱保存。
（3）3.5N氢氧化钠 取14g氢氧化钠，加蒸馏水至100mL，备用。
（4）盐酸溶液 取比重1.18的浓盐酸，用蒸馏水3倍稀释成4N的溶液，室温保存。
（5）0.37M三氯化铁试剂 取10g FeCl3•6H2O，加蒸馏水20mL，再加浓HCl 0.84mL，加温溶解后，加蒸馏水至100mL，室温保存。
（6）碱性羟胺溶液用等体积14%氢氧化钠溶液与1M盐酸羟胺溶液于实验前20min内混匀。
（7）pH 7.2的磷酸缓冲溶液 取Na2HPO4•12H2O 16.7g，KH2PO4 2.72g，加蒸馏水至1000mL，室温较高时宜冰箱保存。
3 器材
恒温水浴，分光光度计，试管架，试管（10mL1 2支），吸管（1mL 3支，2mL 2支，0.5mL 1支，5mL 1支），漏斗7个，50mL烧杯7个等。
取中试管7支，标号，依下列顺序加药并进行操作。
1、取中试管加磷酸缓冲溶液0.85mL (或1mL)，血样0.15mL，置37±1℃水浴中预热3～5min。
2、加入0.007 mol·L-1Ach溶液1.0 mL(1～2管加蒸馏水1.0mL)，于37±1℃水浴中反应40 min，每隔10 min振荡一次。
3、反应40 min后，立即加入碱性羟胺（1 mol·L-1 NH2OH·HCl与3.5N NaOH溶液在用前20 min等容混合，并不时振荡）4.0 mL。
4依次加入4N HCl和0.37 mol·L-1 FeCl3各2.0 mL，每加一种试剂都要充分振荡。
将上述反应液过滤，将滤液倒入1.0 mL的比色杯中，以480 nm的波长比色，详见表2。
通过计算比较正常、中毒及解救后胆碱酯酶活性值，并分析机理，判定本实验中毒程度。
表2 血浆胆碱酯酶活性测定
试剂
管号
磷酸
缓冲液
/mL
全血
37℃
水浴
0.007M
Ach
H2O
碱性
羟胺
4N
HCl
0.37M FeCl3
过滤
光密度
(A)
AchE
活性
//%
标准1
1.0
--
3~5
min
40
4.0
2.0
标准2
0.85
0.15
标准3
药前
计算：
全血胆碱酯酶活性，以0.15mL全血在40min内水解Ach的克分子数（μM）来表示。
（1）酶活性值
全血ChE活性值
样本全血ChE活性值
正常全血ChE活性值
(2) 酶活性值的百分数＝ ×100%
说明：
1 A1、A2、A3和A样分别为对照管Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和样品管的光密度值。
2 A3＋（A2－A1、）为1.0mL Ach、全血和试剂的光密度值。
3 A3＋（A2－A1）－A样为分解的Ach的光密度值。
式中的“7”是每管加入7μM的Ach。A3－A1、即为单纯7μM Ach的光密度值。
八、思考题
1 根据实验结果分析敌百虫中毒原理。
2 比较解磷定、阿托品两药解毒作用的异同，并分析它们解毒的原理。
3 敌百虫中毒及药物（解磷定、阿托品）解救前后胆碱酯酶活性有何变化？为什么？根据血浆胆碱酯酶活性值判断此兔的中毒程度。
九、实验报告
1、预习报告 要明确实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验观察指标及数据处理方法、实验注意事项等。
2、实验记录 家兔在敌百虫中毒前后及阿托品和解磷定解救前后的表现，胆碱酯酶活性测定的结果。
3、实验报告 写明实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验观察指标及数据处理方法、实验注意事项等。根据实验结果，结合思考题进行分析讨论。
十、注意事项
1 测定光密度用分光光度计。λ=480 nm，比色杯厚度1.0 cm，用蒸馏水调零点。
2 对照Ⅰ(无血零点管)为无血，无Ach，由其他试剂和1.0 mL缓冲液及1.0 mL蒸馏水构成。
3 对照Ⅱ（有血零点）为全血及试剂的空白对照，由0.85mL磷酸缓冲液及0.15 mL全血和1.0 mL水及其他试剂构成。
4 对照Ⅲ（标准Ach）为反应系中Ach的对照管。由1.0 mL缓冲液及1.0 mL
Ach构成。
实验二 药物急性毒性研究（LD50)的测定
一、实验目的学习改进寇氏法测定药物LD50的方法、步骤、计算过程。
改进寇氏法测定某药物的半数致死量。动物称重、编号、分组、捉拿、固定、腹腔注射、统计死亡数、计算药物的半数致死量等。
预习药物剂量与死亡效应的关系，半数致死量的概念、含义，测定药物半数致死量的意义等理论知识。
LD50是标志药物毒性大小的一个参数，它是指在一定的实验条件下，一群动物用药后，约半数动物死亡的剂量。测定LD50的实验方法较多，常用的有：改进寇氏法；序贯法；目测图解法等。
测定LD50和ED50的基本条件和要求：
1 动物多用成熟健康正常的小鼠，雌雄兼用，体重18 g～22g。
2 “反应”应大致呈正态分布，最小剂量组的效应百分率（死亡率）应为0%，最大剂量组的效应百分率（死亡率）应为100%。
3 剂量组必须按等比级数（对数剂量组呈等差级数）分组。
4 动物的给药量应为单位体重给药容量相等。
5 动物分组要随机化，且各剂量组动物数应相等。
1 动物 小鼠（18 g～22g），雌雄兼用，每次60只。
2 药品 某药物溶液（戊巴比妥钠），苦味酸溶液等。
3 器材 分析天平，鼠笼，水瓶，粗天平，注射器（1mL 7支），烧杯，量筒，刻度吸管，胶头滴管，玻璃棒，吸耳球等。
改进寇氏法。
1设计方案
⑴探索剂量范围 即估计出引起0%及100%死亡剂量所在的范围。首先用10倍稀释的一系列药液（5～8组），以20 mL·kg-1的容量各试4只小鼠，找出4/4及0/4致死的剂量组，在此组剂量的基础上递减为每kg体重14 mL、10 mL、7 mL、5 mL……或递增为28 mL、40 mL ……再各试4只鼠，如果某组死亡率为4/4，其前一组是2/4或3/4，则可估计该组剂量为100%效应（Dm），如前一组是0/4或1/4、则该组剂量的1.5倍可估计为Dm，同样的方法找出0%效应的量（Dn）。
(2)确定剂量组 即在0%(Dn)～100%(Dm)效应范围内分组，一般以5～8组为宜，各剂量组呈等比级数（比值0.6～0.9），换算成对数剂量后其相邻对数剂量呈等差级数，其差用“i”表示（i须小于0.155），“i”值可按下式计算：
lg最大剂量—lg最小剂量
n－1
ⅰ=
lgDm－lgDn
=
⑶配制系列（低比稀释法）药物溶液 按小鼠腹腔注射药物溶液的容量10 mL·kg-1或20 mL·kg-1配制已确定好的各剂量组药物的浓度，作好标记，备用。
2正式实验
取鼠、称重、标号，随机分为已确定好的组数（5组），每剂量组用鼠10～15只，各组动物数应相等。观察正常的活动状态，按已设计好的剂量组，分别腹腔注射10 mL·kg-1，观察死亡的鼠数，记录之并按下式计算：
⑴ LD50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]
式中，Xm:最大剂量的对数；
i :对数剂量的组间距离；
P:各剂量组死亡率。
⑵ 95%可信限：
LD50±4.5（SlgLD50）•LD50
式中，SlgLD50: lgLD50的标准误；
p：各组死亡率；
n：各组例数。
附表 某药物LD50测定
组 别
剂 量/mL
对数剂量
实验鼠数
/只
死亡鼠数
死亡百分率/%
P
1
(Dm)
2
3
5
(Dn)
1、LD50为何指标？LD50的95%可信限的含义？
2、测定LD50有何意义？
2、实验记录 各组动物的给药剂量、对数剂量、死亡动物数、死亡率等。
3、实验报告 写明实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验观察指标及数据处理方法等。重点是对数据的处理，结合思考题分析实验结果。
１、表中只给出了Ｄｍ、Ｄｎ，根据要求自己计算出其他各组的剂量（Ｄ）及LogD。
２、食物中毒为药物经口进入机体。由于课时关系，本实验采用腹腔注射染毒，造成小鼠急性中毒。
附录——实验课相关的实验动物基本知识和给药方法
（一）实验动物的基本知识
1 实验动物的选择：实验常用动物有蛙、蟾蜍、小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬和猴等。由于动物的种属、品系、性别等不同，对药物的反应性不同。因此，应根据实验的目的、要求来选择适合的实验动物。例如，测定药物的半数致死量或半数有效量需要动物的数量多，常选用小鼠，因小鼠种系清楚，繁殖快、比较经济。
2 实验动物的编号：犬、家兔等较大的动物可用特制的号码牌固定于耳廓上；小鼠、大鼠等，用黄色苦味酸涂于不同部位标号，如给小鼠标记1~10号，可将小鼠背部的肩、腰、臀部按左、中、右分为九个区，从右到左标记1~9号，10号不做标记（见图1）。
图1动物标号示意图
3 相关实验动物的捉拿、固定方法
（1）小鼠：捉拿时动作要轻，先用右手抓住鼠尾，将小鼠放于鼠笼网上，轻向后拉，以左手的拇指及食指捏其双耳和头颈皮肤，无名指、小指和掌心夹其背部皮肤和尾部，便可将小鼠完全固定。
（2）大鼠：大鼠的牙齿尖锐锋利,捉拿时以右手或持夹子抓住鼠尾，左手戴上防护手套抓紧鼠的双耳和头皮，并将背部皮肤固定于左手中，对于身体特别大或凶狠咬人的大鼠，可先以布巾包裹其身（露出口、鼻）, 然后进行操作。
（3）家兔：捉拿时应一手抓住颈部皮肤，将其提起，另一手托住臀部，使兔呈坐位姿势。家兔的固定方法很多，如做颈胸腹部手术应背位固定于手术台上，四肢用绳索捆紧，头部用固定器固定，如做耳静脉或皮下，肌肉注射，应固定于兔筒进行。
4 相关实验动物的取血方法
（1）小鼠、大鼠取血法
①股静脉或股动脉取血：麻醉动物，背位固定，切开腹股沟皮肤，剥离暴露出股动、静脉，可用针刺入取血或切断放血，大鼠亦可以股动脉插入胶管多次连续放血；350g体重大鼠可采8~10mL；500g体重可采15mL。
②尾尖取血：将小鼠尾部剪掉1~2mm，然后自尾根部向尖端按摩，血即可流出。亦可用刀片交替切割鼠尾三根静脉取血，每次可取0.3~0.5mL，此法可间断取血进行常规检查。
③眼眶后静脉丛取血：固定鼠头部皮肤，轻轻向后压迫颈部两侧，使头部静脉回流受阻，眼球充分外突，用内径1~1.5mm的毛细玻璃管刺入眼睑与眼球之间,轻轻向眼底部方向移动,血即可流入玻璃管内,一般两眼可各取一次。
④断头取血：用剪刀剪断鼠头，立即将鼠颈部向下，提起动物，并对准已准备好的容器，可接所需血液。
（2）家兔取血法
①心脏取血：将家兔背位固定，在胸骨左缘3mm，第3~4肋间隙，触及心跳最明显部位，以8号针头刺入，即可有血自流注射器内，亦可抽取，如没刺入心脏，一定要将针提到皮下改变方向，再重新刺入。
②耳缘静脉取血：将耳根部压紧，拔去耳缘毛，用酒精棉球涂擦使血管扩张明显，以6～7号针头，针尖向离心方向刺入，缓慢抽取血液，也可用刀片从末端处切断，即可取血。
③股静脉、股动脉取血：将家兔麻醉，背位固定，手术分离出股动脉或静脉，插入套管即可根据需要量取血。
5 相关实验动物的处死方法
实验结束后，须将动物处死，方法如下：
①颈椎脱臼法，：此法适用于小鼠，手持镊子或用拇指、食指固定小鼠后头部，捏住鼠尾，用力向后上方牵拉，使之颈椎脱臼死亡。
②心脏取血法：用粗针头刺入心脏一次抽取大量血液，可致动物立即死亡。此法适用于豚鼠、家兔、猴等。
③大量放血法：此法常用于犬、猫等。麻醉犬，可横向切开股三角区，切断股动静脉，血液立即喷出，同时用自来水冲洗出血部位，以免血液凝固。动物可在3~5min内死亡。麻醉猫，可切开颈三角区，分离出动脉，以动脉夹夹住上下两端，插入动脉插管后再松开下方动脉夹，轻压胸部可放大量血液，动物立即死亡。
④空气栓塞法：用注射器将空气迅速注入静脉，可致动物立即死亡。家兔、猫致死空气量为10~20mL，犬为70~150mL。
（二）相关实验动物的给药方法
1 注射给药法
（1）腹腔注射法
①小鼠：以左手抓住小鼠（方法同灌胃）,右手持注射器（宜用5~6号针头），取45°角将针头从下腹部向头端刺入腹腔。进针部位不宜太高，刺入不能太深，防止刺破内脏，注射量为0.1~0.2mL·10g-1体重。
②大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬：腹腔注射皆可参照小鼠腹腔注射法。
（4）静脉注射法
家兔：家兔静脉注射一般采用耳缘静脉（耳外缘的血管为静脉，中央的血管为动脉）。将家兔置固定筒内，拔去耳壳外缘毛，用酒精棉球涂擦耳缘静脉部皮肤，使血管充分扩张。用左手拇指和中指捏住兔的耳尖部，食指垫在兔耳注射处下面，右手持带有6号针头的注射器，从耳尖部向心端刺入静脉，以左手使针头和兔耳固定，将药液推入。若有阻力和局部皮肤发白隆起，表示针头在血管外，此时将针头稍退回，再重新穿刺血管，注射完毕，用棉球压住针眼，拔去针头，注射量一般为1.0~2.0mL·10g-1。
