《中药指纹图谱》
课程编号：1241531041
实验指导书
主撰人 解军波
审核人 李建颖
天津商业大学生物技术与食品科学学院
二〇一二年十月
实验一中药色谱指纹图谱研究过程中的关键问题
一、实验目的
1、了解中药指纹图谱研究的方法与技术，熟悉HPLC的基本组成和构造
2、了解中药指纹图谱研究中样品处理方法、色谱条件确定与优化方法，特征峰选取。
二、实验内容
利用HPLC法初步建立酸枣仁药材的的指纹图谱。
三、实验要求
以自主训练为主的开放模式组织教学，熟悉HPLC的操作及注意事项。
四、实验准备
复习仪器分析、天然药物化学中相关中药鉴定的相关知识，温习HPLC的使用方法和相关事项。
五、实验原理、方法和手段
中药指纹图谱，是指某种（或某产地）中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其特性的光谱或色谱图。
中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它建立在中药系统研究的基础之上，主要用于鉴别真伪和评价原药材、半成品及制剂质量的均一性和稳定性，基本属性是“整体性”和“模糊性”。建立中药指纹图谱能针对中药多成分、多途径、多靶点作用特点，较为全面地反映中药中所含内在化学成分的种类与数量，进而有效地表征其质量，对中药材，中药制剂的规范化生产，对进一步研究中药的作用机理、物质基础和量效关系，提高其质量都具有重要的意义。
六、实验条件
1高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、色谱工作站
2超声波清洗仪、过滤装置
3甲醇、乙睛为色谱纯，重蒸水其它试剂均为分析纯、复方丹参注射液
七、实验步骤
1供试品溶液的制备 取精密量取注射液1ml,稀释，备用。
2对照品溶液的制备 由于原儿茶醛为该药中主要成分，在HPLC分析中，组分峰面积在指纹图谱中所占的比例较大且较为稳定，可选之为对照品。准确称取原儿茶醛适量，用流动相定容至5mL，备用。
3测定条件的选择：
（1） 流动相的选择：预先设定三种流动相系统（甲醇-水系统、乙睛-水系统、甲醇-0.1%冰醋酸系统）进行实验，并适当调节流动相比例，保证谱图中各色谱峰分离较好，保留时间适中，在比较三种系统分离效果的基础上，确定最佳流动相条件。
（2）检测波长的选择：实验中通过二极管阵列检测器，分别比较在210nm、254nm、280nm、325nm的色谱图，根据色谱峰的个数，及各峰之间的分离度情况，确定最佳的检测波长。
（3）其它条件：柱温定为30℃，流速为1mL/min。
4测定方法：分别取各批注射液供式样品10μL进样，按上述条件记录各色谱峰的保留时间和积分面积（每批供试样品重复2次）。
5方法学考察：（了解）
（1）精密度实验：取同一份样品，连续进样5次，计算各色谱峰的相对保留时间与相对峰面积，RSD%不得大于3%。
（2）重复性实验：取同一批样品，制备5份，按上述方法测定，计算各色谱峰的相对保留时间与相对峰面积，RSD%不得大于3%。
（3）稳定性实验：取同一份样品，分别在0小时、1小时、2小时、4小时、8小时进行测定，计算各色谱峰的相对保留时间与相对峰面积，确定供试品溶液的稳定性。
6丹参葡萄糖注射液HPLC指纹图谱及技术参数的确定及处理
（1）指纹图谱及共有指纹峰的标定：根据5批供试品HPLC图谱所给出的相关参数，确定供试品的所有成分色谱峰的完全出峰时间。比较各批样品的色谱图，确定各批样品的共有峰。
（2）共有指纹峰面积：以原儿茶醛为参照，计算各指纹峰的相对保留时间和相对积分面积。
（3）非共有峰面积：非共有峰面积占总峰面积应小于5%。
八、思考题
1.根据各色谱峰的色谱行为，推断各色谱峰的化学结构归属。
2.通过对以上复方丹参注射液的指纹图谱初步建立的步骤，请你总结出建立中药指纹图谱的方法及注意事项。
九、实验报告
认真写好实验报告，实验报告要清楚、简练、整洁，数据处理符合分析要求。内容包括：实验名称、目的要求、实验原理、仪器与试药、操作步骤、实验结果、讨论。
十、注意事项及其它说明
注意仪器软件的操作步骤和仪器保护。
实验二 中药色谱指纹图谱的建立与评价
了解并熟悉常用中药指纹图谱软件的使用方法
利用中药指纹图谱软件分析评价相关数据，建立指纹图谱。
以学生自主训练为主的开放模式组织教学，熟悉中药指纹图谱软件的操作及注意事项。
复习仪器分析、天然药物化学中相关中药鉴定的相关知识。
指纹图谱的评价指标是以供试品指纹图谱与该品种对照用指纹图谱(共有模式)之间的相似性来衡量的，这种相似性比较可以用“相似度”表达。国家食品药品监督管理局颁布的《中药注射剂指纹图谱实验研究技术指南》规定：指纹图谱相似度可以借助国家药典委员会推荐的“中药计算机辅助相似度评价软件”计算。一般情况下当成品相似度计算结果在0.9～1.0(90％～100％)时视为符合要求。
2国家药典委员会颁布，A版（研究版），
1.数据导入
2.数据预处理和色谱图的缩放比较
3.保留时间校正和谱峰自动匹配
4.指纹图谱相似度计算
5.结果输出和报表打印
通过软件的学习，讨论现有软件的优点和缺陷（改进之处）。
九、实验报告同1
十、注意事项及其它说明同1
