《制药分离工程》

《制药分离工程》

课程编号：1241532019

实验指导书

主撰人 赵彦巧

审核人 李建颖

天津商业大学生物技术与食品科学学院

二〇一〇年九月

前 言

1.实验总体目标

《制药分离工程实验》是制药工程专业的专业实验课。包括膜分离实验、离子交换分离氨基酸等实验。

《制药分离工程实验》使学生把制药分离工程理论与实践相结合，掌握有关膜分离、离子交换分离药物有效成分的专业知识和专业技术，为毕业后从事制药工程的生产，技术改造，工艺设计和研制开发奠定牢固的专业技术基础。

⒉ 适用专业、年级、课程及课程编号：

制药工程专业大三年级《制药分离工程》课程编号：1241532019

⒊ 先修课程

有机化学、物理化学

⒋ 实验课时分配

实验项目

实验要求

实验类型

每组人数

实验学时

实验一 离子交换分离氨基酸

必做

综合

2

9

实验二 膜分离—超滤

必做

综合

2

7

⒌ 实验环境

实验室的标准温度为20℃,实验室内的相对湿度一般应保持在50－70％。实验室的噪音、防震、防尘、防腐蚀等方面的环境条件应符合在室内开展的检定项目之检定规程。

⒍ 实验总体要求

掌握制药分离的理论知识、基本方法、基本操作技能，要求操作正确、态度严谨认真，具有独力工作的初步能力。正确掌握和灵活处理各个环节的操作技能是训练学生严格认真的科学态度与良好工作习惯，促进理论与实践结合的一个重要环节。

⒎ 本实验的重点、难点及教学方法建议

为了保证实验的正常进行和培养学生良好的实验作风及保证实验质量，学生必须遵守下列要求：

1、实验前必须充分预习实验讲义，明确实验目的、要求，防止实验盲目性，讲求实验质量。

2、实验时要严格按照规范操作进行，仔细观察实验现象，认真记录有关数据。要善于思考，学会运用所学理论知识解释实验现象，研究实验中的问题。

3、重视安全操作，遵守实验室安全守则，使用易燃、易爆、有毒物品时要小心谨慎，避免事故发生。

4、要认真写好实验报告，实验报告要清楚、简练、整洁。

目 录

实验一 离子交换分离氨基酸

………………………………………………

4

实验二 膜分离—超滤

………………………………………………

8

实验一 离子交换法分离氨基酸

一、实验目的及要求

学习和掌握用离子交换树脂柱层析法分离氨基酸的基本原理和方法步骤及其应用。

二、实验原理

离子交换层析法是指溶液中的离子通过与离子交换剂上的解离基团进行连续的交换平衡而达到分离的方法。也就是说，它是根据不同物质的酸碱度，极性和分子大小不同，因而与离子交换剂上的基团交换的速度，结合能力的差异而予以分离的技术。40年代末，由于高分子化学的发展，采用了人工合成的不溶性高分子化合物作为离子交换剂即离子交换树脂，使得这一技术迅速发展，广泛应用于化工、医药等部门。

离子交换层析技术除大量应用于分离生物化学代谢物质的工业生产外，还大量应用于生物化学和分子生物学的理论研究。近年来该技术与其他技术相结合，制成了固相肽自动合成装置，氨基酸自动分析仪，核苷酸自动分析仪，气相色谱仪，蛋白质合成仪等。离子交换层析技术已经成为生化领域各个方面的基本技术之一。

1、离子交换剂的结构

离子交换过程可归纳为：

（1）溶液中的带电粒子经过扩散透过交换剂的外表面到达交换剂的内表面；

（2）这些带电离子占据交换剂原有自由离子的位置；

（3）交换剂中原有离子自交换剂孔隙中扩散到交换剂的表面而进入到溶液中去。根据这一过程交换剂的结构必须是疏松、多孔如海绵那样的结构，必须含有相当数量的可交换离子，必须是不溶性的，具有很稳定的化学性质如耐酸耐碱，耐冷耐热，耐磨损。如常用的聚苯乙烯磺化型阳离子交换树脂即是由磺化苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的。

苯乙烯形成网的直链，其上带可解离的磺酸基，二乙烯苯把直链交联起来形成网状，即得到不宜破碎的疏松的网状结构，又获得了许多可解离基团的特性。但值得注意的是，交联结构多时分子结构紧密，孔洞就小。分子量大的离子就不能进入颗粒内发生交换作用，各种交换剂都附有“交联度”规格。例如“华东201×8”意思是上海华东化工学院出品的强碱型阴离子交换树脂，交联度是8%，即制备树脂时，二乙烯苯的量占单体总量的8%。另一种常用的树脂母体是聚酚甲醛，称为酚醛树脂。

近年来，还使用纤维素和葡聚糖，制成离子交换纤维素和离子交换葡聚糖，主要用来分离蛋白质，核酸与抗生素这类不太稳定的生化物质效果尤为理想。有人认为这两类多糖骨架都来源于生物材料，具有亲水性，对生物活性物质是一个十分温和的环境。

2、离子交换剂的分类

目前主要根据离子交换剂的性能分为阳离子交换剂，阴离子交换剂，氧化还原交换剂，选择性交换剂等

（1）阳离子交换剂

这种交换剂可分为强酸型，中性酸型，弱酸型三类。强酸型含有磺酸基团（-R-SO₃H）中强酸型含有磷酸根（-PO₃H₂），亚磷酸根（-PO₂H₂）或磷酸根（-O-PO₂H₂），弱酸型含有羧基（-COOH）或者酚羟基（-OH）。

三者中以中强酸型使用较少，常用的离子交换剂有阳离子交换树脂，葡聚糖凝胶阳离子交换剂，阳离子交换纤维素，阳离子交换膜等。

（2）阴离子交换剂

阴离子交换剂也可分为强碱性，中强碱性和弱减性三类。阴离子交换剂都含有氨基，如含季胺盐[-N⁺（CH₃）]为强碱性;叔胺[-N(CH₃)₂],仲胺,(-NHCH₃),伯胺(-NH₃)类都属于弱碱性;即含强碱性基团,也含弱碱性基团的交换剂即是中强碱性交换剂.常用的离子交换剂有阴离子交换树脂,阴离子交换纤维素,葡聚糖阴离子交换剂,阴离子交换膜等.

3、交换剂的处理、再生与转型

新出厂的树脂如果是干树脂,要用水浸透使之充分吸水膨胀.又因含有一些水不溶性的杂质,所以要用酸、碱处理除去.一般方法是：新出厂的干树脂用水浸泡2小时后减压抽去气泡，倾去水，再用大量的无离子水洗至澄清，去水后加4倍量2mol/LHCl搅拌4小时，除去酸液，水洗至中性，再加4倍量2mol/LnaOH搅拌4小时，除碱液，水洗到中性备用。用过的树脂使其恢复原状的方法俗称“再生”。再生时并非每次都用酸碱反复处理，往往只要转型就可以。所谓转型就是说使用时希望树脂上带上何种离子。如希望树脂带Na⁺，则用4倍量2mol/LnaOH搅拌浸泡2小时以上；如希望树脂上带H⁺则用HCl处理；如希望树脂上带OH^-则用NaOH处理；再生和转型的结果是希望树脂带上我们所需要的离子，因此最后的处理即是转型处理。最后若用碱，而碱之前必用酸，酸碱会中和，在酸或碱处理之后都必须水洗至中性，这是一般的处理方法，如果树脂长期使用杂质含量过高时，可在酸碱处理前用沸水处理，或用热酸与热碱处理，甚至用低级的醇或酮等有机溶剂处理，视需要而定，原则是这些处理方法不会引起树脂的破解而又能使树脂保持原来的交换量。

4、离子交换树脂分离氨基酸的原理

组成蛋白质的20种氨基酸的结构不同，所以各氨基酸等电点各异，在同一种环境中，每种氨基酸所带电荷不同，带电荷越多越易交换，那么洗脱时就较困难。相反，带电荷少则不易交换，然而容易洗脱，所以用阳离子交换树脂分离氨基酸时，碱性氨基酸容易交换，但不易洗脱，而酸性氨基酸则相反，洗脱时的顺序应该是酸性氨基酸＞中性氨基酸＞碱性氨基酸。这样就能把不同的氨基酸分离开来，由于被吸附的氨基酸是混合的，所以除了正确选择洗脱液外还采用控制流速和分步收集器的方法来获得单一的氨基酸，因不同氨基酸的极性不一，离子或基团的亲和力不同，与洗脱液交换的速度也不同，根据先后洗脱顺序就可以得到较纯的单一氨基酸。进而达到分离的目的。

同理也可用阴离子交换树脂分离氨基酸。离子交换树脂只能分离氨基酸、荷苷酸、抗生素等小分子物质，而对大分子的蛋白质、核酸、酶则不易进行，因为空隙太小，大分子不易进入空隙中，但可用离子交换纤维素和离子交换葡聚糖进行分离纯化。

三、试剂和器材

1、试剂

1）苯乙烯磺酸型树脂（强酸型1×8 732^# 100目~200目）

2）2mol/LHCl溶液

3）2mol/LNaOH溶液

4）标准氨基酸溶液，天冬氨酸、赖氨酸和组氨酸均配置成2mg/ml的0.1mol/LHCl溶液

5）混合氨基酸溶液，将上述天冬氨酸、赖氨酸和组氨酸各溶液按1：5：10的比例混合。

6）柠檬酸—氢氧化钠—盐酸缓冲液pH5.8，钠离子浓度0.45mol/L），取柠檬酸（C₅O₇H₆·H₂O）14.25g，氢氧化钠9.30g和浓盐酸5.25ml溶于少量水后，定容至500ml，冰箱保存。

7）显色剂，2g水合茚三酮溶于75ml乙二醇单甲醚中，加水至100ml。

8）50%乙醇水溶液

2、器材

1） 层析柱20cm×1cm

2） 小试管

3） 吸管

4） 50毫升量筒、烧杯

5） 蠕动泵

6） 分部收集器

7） 水浴加热器

8） 电炉

9） 721—分光光度计。

四、操作步骤

1、树脂的处理

将干的强酸型树脂水浸泡过夜或搅拌2小时，使之充分膨胀，再用4倍体积的2mol/L浸泡1小时或搅拌半小时，倾出清夜，用无离子水洗至中性，再用2mol/LnaOH处理，作法同上，最后用2mol/LHCl如上法处理，使成为氢型，洗至中性待用。

2、装柱

取一支直径1cm，高16—18 cm的层析柱,固定在铁架台上，如图1所示，将转型或再生好的树脂放入小烧杯中，加少量水，边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，一定要使树脂缓慢下沉。必须注意的是交换剂在柱内必须分布均匀，严防有节或气泡产生，否则将严重影响交换性能，“节”是指交换剂在柱内有明显的分界线，是由于装柱时树脂沉降不均匀，造成树脂在柱内排列松紧不一而造成。气泡是由于树脂未被溶液完全包裹而与空气接触所引起，防止节与气泡产生的方法是装柱时柱内先保持一定高度的水分（一般为柱长的1/3），加入树脂时树脂借水的浮力而慢慢沉降，如果保持树脂面上水的高度不便（可借排泄口放水的方法控制），树脂是连续缓慢沉降,节与气泡就不会产生。

3、样品上柱

装柱完毕后，用pH为5.8的柠檬酸缓冲液平衡交换柱，调节蠕动泵使缓冲液通过树脂柱的流速为0.5ml/min，流出液达树脂床体积的4倍时即可上样，将分部收集器准备好，由树脂柱上端仔细加入氨基酸混合液0.25~0.5ml，同时开始收集流出液。当样品液弯月面靠近树脂面顶端时，再加入0.5ml柠檬酸缓冲液冲洗加样处，待缓冲液弯月面靠近树脂顶端时，再加入0.5ml缓冲液，如此重复两次。

4、洗脱与收集

将柠檬酸缓冲液水浴加热至50℃，通过蠕动泵将其连续加入树脂床进行氨基酸洗脱，同时通过分部收集器每隔一定时间收集1ml洗脱液，约收集80管。

5、氨基酸的鉴定

向各管收集液中加1ml水合茚三酮显色剂并混合均匀，在沸水中准确加热15min后冷却至室温，再加入1.5ml的50%乙醇溶液，放置10min后进行测试。以第二管收集液为空白，以570nm波长测定光吸收值，以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线。并与图2进行对照，可确定峰是由何种氨基酸产生。

图2为参照图，将已知浓度的三种氨基酸的纯溶液，分离的具体条件为层析柱高18厘米，操作压72厘米，流速0.5毫米/升，收集量1毫升/管。室温15℃。上样量：天冬氨酸0.04毫克，赖氨酸0.1毫克，组胺酸0.4毫克，既取混合氨基酸（1：2.5：10体积比）0.27毫升。按上述方法和操作条件，得到的混合氨基酸曲线洗脱曲线，

实验二 膜过滤——超滤

一、实验目的

1． 熟悉一般的超滤设备；

2． 了解超滤的工艺原理，截留分子量（WMCO）和水通量的基本概念；

3． 了解超滤过程中的工艺参数，如压力，温度等；

4． 应用超滤方法对蛋白质等大分子进行浓缩，或分离药用有效成分。

二、实验原理

膜过滤技术采用的是具有特定性质的半透膜，它能选择性地透过一种物质，而阻碍另一种物质。膜过滤是以压力为动力，依靠膜的选择性将液体中的组分进行分离的方法，它包括微滤MF（Microfiltration）、超滤UF（Ultrafilfration）和反渗透RO（Reverse osmosis）等膜分离过程。当含有大、小分子物质的两类溶质的溶液流过被支撑的膜的表面时，溶剂和小分子物质将透过膜，作为透过物被收集起来，大分子溶质将被薄膜截留而作为浓缩液被回收。膜工作原理示意图如图1

事实上，微滤、超滤和反渗透这三种过程并没有本质上的区别，每种膜都可用相同的方法来制备，各种膜的孔径范围如图2所示，它们的孔径范围有一定程度的重叠。表征膜性能的参数主要有膜的孔径大小、孔径分布、空隙度、膜的截留分子量MWCO（Molecular Weight Cut Off）、水通量（以cm³/cm³.h表示）、抗压能力、PH适用范围、对热和溶剂的稳定性等。膜的水通量是指单位时间、单位膜面积透过水的体积，它一般采用纯水在0.35Mpa、25℃条件下进行试验而得到。膜在使用过程中,大分子物质不能像溶剂那样容易通过膜,而将产生以下情况被吸附在过滤膜的表面和孔中(基本吸附)被保留在孔内或者从那里被排出(堵塞)机械地被截留在过滤膜的表面上(筛分),以上情况将造成水通量下降很快，在处理蛋白溶液时，实际通量为纯水的10%左右。

超滤膜对溶质的截留能力用截留率σ来表示，其定义为： σ=1-C_P/C_B

式中C_P、C_B 分别表示在瞬间透过液和截留液的溶质浓度。当σ=1时，表示溶质全部被截留；当σ=0时，C_P=C_B，表示溶质能自由透过膜。截留分子量（MWCO）定义为相当于一定截留率（通常为90%或95%）时溶质的分子量。

大分子蛋白质，酶的分子量一般为20,000~200,000，可用MWCO 10,000的膜进行浓缩和去除低分子量的杂质，收率为95%以上。

三、实验材料及装置

1、 实验材料：蛋白质溶液或发酵液或中药提取液。

2、 中空纤维超滤装置。

四、实验方法

1、 固定恒流泵压力及流速，关闭回流阀，测定20min内水通量；

2、 布氏漏斗，滤纸粗滤5000mL蛋白质溶液或发酵液，超滤膜超滤，使其浓缩5倍，分别测定原液，截留液和透过液的产物浓度；

3、 水洗膜后再测水通量

五、实验结果

1、 计算不同浓缩倍数时的产物收率；

2、 水通量的变化。

六、思考题

1、 浓缩倍数与收率有何关系？

2、 膜的水通量为何随使用次数的增加而下降？

七、参考文献

1、 俞俊棠等，生物工艺学，上册，华东理工大学出版社，1992

2、 顾觉奋等，分离纯化工艺原理，中国医药科技出版社，1993

3、 Cheryan，M.Ultrafiltration handbook，TechnomicPublishing Comapany，Inc.,Lancaster, Basel ,1986

4、 FaneA.G.Separation processes in Biotechnology.Juan A.Asenjo(ed.)Marcel DekkerInc.,New youk and Basel．1990

附：学生自行设计原液，截留液和透过液的产物浓度测定方法

1．例如，对蛋白质大分子溶液进行浓缩用的原液，截留液和透过液的产物浓度测定方法

（1）标准酪蛋白溶液（5mg/ml）：用0.05mol/l氢氧化钠配制

（2）双缩脲试剂：溶解1.5g硫酸铜（CuSO45H₂O）和6.0g酒石酸钾钠于500ml水中，在搅拌下加入300ml的10%氢氧化钠溶液，用水稀释到1L，储存在内壁涂以石蜡的瓶中，可以长期保存。

（3）标准曲线制作：取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml的标准酪蛋白溶液，分别加入试管中，每支试管用水补至2ml后，加4毫升双缩脲试剂，分别混匀，于37℃水浴箱中放置30min用540nm波长进行比色，以空白管校“0”，读取各管消光值，以消光值为纵坐标，酪蛋白（质量分数）为横坐标，绘标准曲线，作为定量的依据。

测定原液，截留液和透过液的产物浓度

2．如果超滤分离发酵液中抗生素成分，学生自行根据抗生素化学成分不同，设计相应测定方法。

3．如果超滤分离中药的黄酮、皂苷或生物碱等药用成分，学生自行根据所分离中药的不同成分，设计相应测定方法。