《生理药理学》
课程编号：1241535004
实验指导书
主撰人 王丽娟
审核人 李建颖
天津商业大学生物技术与食品科学学院
二〇一三年九月
前 言
1.实验总体目标
生理药理学是一门实验性科学，药理学实验课是药理学教学的重要组成部分。它不仅可以强化和加深学生对药理学基本理论和知识的认识，更重要的是可以通过实验课培养学生的科学思维，动手操作能力，独立分析问题和解决问题的能力。通过课堂的实训，使学生们了解动物实验的基本要求，熟悉基本操作，了解药理学实验研究的常用方法和结果的处理方法，为今后的工作奠定初步的基础。
⒉ 适用专业年级：药事管理、制药工程、生物工程
⒊ 先修课程：人体解剖生理学，生物化学，微生物学
⒋ 实验课时分配：16
实验项目
实验要求
实验类型
每组人数
实验学时
实验一 水杨酸钠血浆半衰期的测定
必做
综合
7-9人
4
实验二 药物对离体肠管平滑肌的作用
实验三 热板法观察药物的镇痛作用
实验四 药物半数有效量的测定
……………
⒌ 实验环境
需要计算机、打印机等至少3套；实验室要保证一定的温度和湿度；室内要保证空气清新，定期消毒等。
⒍ 实验总体要求
实验前要进行课前预习；实验课除因病或必须请假的急事之外不得缺勤；因动物的原因，缺勤不予补课；课堂上要积极动手操作，认真记录；课后完成实验报告的书写；等。
⒎ 本实验的重点、难点及教学方法建议
生理药理学实验的重点是要学生了解本学科是一门实验性学科，了解动物实验常用的基本操作方法，药理学实验常用的检测及记录方法，等。难点是动物的动手操作。建议在实验条件允许的情况下，尽量放手让学生操作。
目 录
实验一 水杨酸钠血浆半衰期的测定 ……………………… 1
实验二 药物对离体肠管平滑肌的作用 ……………………… 2
实验三 热板法观察药物的镇痛作用 ……………………… 5
实验四 药物半数有效量（LD50））的测定 ……………………… 7
附录 10
一、实验目的了解分光光度法测定水杨酸钠的血药浓度和计算半衰期的方法。
二、实验内容 家兔静脉采血、静脉注射、离心、光电比色等。
三、实验要求 集中授课形式。
四、实验准备 预习药物代谢动力学，药动学参数的概念、意义、计算方法等理论知识。
五、实验原理、方法和手段
在酸性条件下，水杨酸钠解离为水杨酸，后者与三氯化铁生成一种紫色络合物，该络合物在520nm波长处，其光密度与水杨酸的浓度成正比。
采用光电比色法，计算血药浓度，进一步计算药物的半衰期。
六、实验条件
1.动物 家兔，2～3kg，雌雄均可。
2.药品 10%及0.02%水杨酸钠（sodium salicylic），10%三氯化铁，10%三氯醋酸（trichloroacetic acid），0.5%肝素（heparin），蒸馏水。
3.器材 试管架、试管、离心管、吸管（10mL、2mL、1mL 0.5mL）、注射器（2mL、5mL）、针头、吸耳球、分光光度计、离心机等。
七、实验步骤
1、取4支离心试管，编号后各加入10%三氯醋酸5mL。
2、取家兔一只，称体重，使其耳部充血后，用经0.5%肝素湿润过的注射器由耳缘静脉缓慢抽血2.5mL，分别置于1号管和2号管内各1 mL，余血弃掉，将试管摇匀静置。
3、由耳缘静脉缓慢注射10%水杨酸钠1.5 mL/kg，（150mg/kg），给药后5min和35min，各采血1mL，分别置于3号管和4号管内，摇匀静置。
4、1，3，4号管内各加入蒸馏水1mL，2号管内加入0.02%水杨酸钠1mL。摇匀。
5、将4支离心管置于离心机内，以3000rpm离心5min，使血浆蛋白沉淀。
6、另取相应编号的试管4支，将离心后的上清液倒入相应编号的试管中，从中各准确吸取3mL分别置入相应编号的另外4支试管中，每管再加入10%三氯化铁溶液0.5mL，摇匀显色。
7、以1号管为对照管，用分光光度计在波长520nm处测定其余3管的光密度值，由2号管的光密度值（Y2）和浓度（X2）求比值K，即K=X/Y（恒定）。再根据X=KY，由Y3和Y4求得X3和X4，即药后5min和35min时的血药浓度，根据下列公式求出半衰期（t1/2）。
0.301
t1/2=
（lgX3-lgX4）/△t
注：式中X3和X4分别为给药后5min和35min时的血药浓度，△t为两次取血的间隔时间（30 min）。
结果与处理：将实验结果列入表1中，根据实验结果计算半衰期。
表1 水杨酸钠血药浓度测定步骤与结果记录
试管
（编号）
10%三氯醋酸/mL
血
/mL
蒸馏水/mL
0.02%水杨酸钠/mL
10%三氯化铁/mL
光密度 (Y)
K值(X/Y)
C
/μg·mL-1
1（对照）
5.0
1.0
-
0.5
2（标准）
3（药后）
4（药后）
八、思考题
1、测定药物的t1/2有何临床意义？
2、什么情况下药物的t1/2会延长？
九、实验报告
1、预习报告 要明确实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验观察指标及数据处理方法、实验注意事项等。
2、实验记录 所测各管的光密度值。
3、实验报告 写明实验目的、实验原理、实验材料、实验步骤、实验观察指标及数据处理方法等。重点是对数据的处理，结合思考题分析实验结果。
十、注意事项
1、本实验属分析性的，操作必须准确，取血间隔的时间△t要根据各实验者操作的准确时间而定。
2、取血时可采用多种取血方式，如心脏取血、动脉取血等，取血用的注射器在取血前要用0.5%肝素润洗，以防血凝。
一、实验目的
1.学习离体平滑肌器官的实验方法。
2.观察乙酰胆碱、阿托品、组织胺、扑尔敏和某药等药物对离体回肠平滑肌的作用，并分析其作用原理。
二、实验内容 熟悉离体器官实验的方法，观察肠平滑肌收缩曲线的记录方法。多种药物对离体肠管活动的影响。
四、实验准备 传出神经系统药物的分类、药理作用、作用机制，肠平滑肌上分布的受体、兴奋后产生的效应。
消化道平滑肌除具有肌肉的共性外，尚具有不同于心肌和骨骼肌的特性，主要表现在其自动节律性缓慢而不规则，伸展性较大，兴奋性较低，具有一定的紧张性，对电刺激和切割不敏感，而对温度变化、牵拉、酸碱、乙酰胆碱等理化因素敏感等。
本实验观察M胆碱受体激动药和阻断药、组胺受体激动药和阻断药以及某药对小肠平滑肌的作用，并理解和分析药物的作用机制。
1.动物：家兔，2～3kg，雌雄均可。
2.器材：BL-420F生物信号采集处理系统、计算机、打印机、恒温循环水浴各1台，麦氏浴管、张力换能器、气袋、通气钩、铁支架、止水夹各1个，1mL注射器5个，培养皿、250mL烧杯、100mL烧杯、搪瓷盘、污物缸各1个，十字夹1套，普通剪刀、组织剪、眼科剪、止血钳各1把，丝线、打印纸若干。
3.药品：台氏液、0.1%氯化乙酰胆碱溶液、0.05%硫酸阿托品溶液、1%磷酸组织胺溶液、0.1%扑尔敏溶液、某药溶液。
1.标本制备：取家兔一只，置于手中倒悬，以木槌击头致死，立即打开腹腔，找到回盲部，在离其2～3cm的回肠处剪断，取出回肠，置于盛有台氏液的培养皿中，沿肠壁分离并剪去肠系膜，将肠管剪成数段，轻轻冲出肠内容物，最后将肠管剪成2～3 cm的小段备用。
2.冲洗浴管，并在其中加入台氏液约30mL（标线处），打开恒温水浴，设定温度为37℃，并打开循环开关。
3.取上述备用回肠一段，两端用丝线结扎并用挂钩挂住，一端挂在通气钩上，放入浴槽，另一端连于张力换能器。通气钩另一端与气袋相连，缓慢通入气泡，并调节1～2个气泡/秒。
4.打开计算机，进入BL-420F生物信号采集系统，选择“通道1 →张力”，实验项目下的“药理实验”，“药物对离体肠平滑肌的作用”。调整肠管的张力，使之适度。
5.观察项目：待肠管在浴管内稳定10 min左右，记录一段正常活动曲线，然后用注射器依次向浴槽中滴加药液。每加一个药后立即标记，并观察、记录肠管的收缩幅度。待药物的作用明显及肠管的活动平稳后加入下一个药物。
第一组药物：
（1）0.1%氯化乙酰胆碱溶液0.2mL；
（2）0.1%硫酸阿托品溶液0.2mL；
（3）重复给（1）。
用台氏液冲洗1～2遍，加入新鲜台氏液，待肠管活动稳定后，记录一段正常收缩曲线，然后加入第二组药物。
第二组药物：
（4）1%磷酸组织胺溶液0.3mL，作用明显时加入（5）；
（5）0.1%扑尔敏溶液0.3mL；
（6）重复给（4）。
用台氏液冲洗1～2遍，加入新鲜台氏液，待肠管活动稳定后，记录一段正常收缩曲线，然后加入第三组药物。
第三组药物：
（7）某药溶液1mL；
（8）0.1%硫酸阿托品溶液0.2mL；
（9）重复给（7）。
用台氏液冲洗1～2遍，加入新鲜台氏液，待肠管活动稳定后，记录一段正常收缩曲线，然后加入第四组药物。
第四组药物：
（10）某药溶液1mL；
（11）0.1%扑尔敏溶液0.2mL；
（12）重复给（10）。
6.切断电源，取出回肠，冲洗浴槽，整理实验台其他物品。
1.乙酰胆碱和阿托品对小肠平滑肌的作用及其作用机制？
2.组胺和扑尔敏对小肠平滑肌的作用及其作用机制？
3.阿托品和扑尔敏对某药的作用有什么影响？根据实验结果分析其作用机制。
2、实验记录 根据实验步骤的要求记录肠收缩曲线。
3、实验报告 整理实验结果，剪接描记曲线并打印。结合思考题对实验结果进行分析。
1.冲洗和分离肠管时动作应轻柔，尽量避免牵拉肠管；标本制备好后，放在盛有台氏液的培养皿中保存，以免影响标本的反应性。肠管两端穿线时，切勿将肠管缝死，只需穿过一层肠壁。
2.实验前后应将浴槽彻底清洗，以免残留药物影响实验结果。
3.台氏液必须新鲜配制，温度保持在37℃～38℃。
4.通气时使气泡呈小米粒大小均匀上升，水泡不宜过大。
5.调节连线松紧度，并且线应垂直桌面。
6.加药时不要把药液直接加到回肠上，以免影响结果。
7.浴温和肠肌的张力均可影响实验结果，应注意调节。
一、实验目的用热板法观察某药的镇痛作用，并学习镇痛药物的筛选方法。
二、实验内容 小鼠捉拿、固定、分组及腹腔注射等操作方法，热板测痛仪的使用。
四、实验准备 镇痛药的作用、作用机制、临床应用、不良反应及使用注意。
将小鼠置于恒温的热金属板上，热刺激小鼠足部产生疼痛反应（舔后足），记录小鼠从放于热板上至出现疼痛反应即舔后足的时间（痛阈值），比较用药组与对照组小鼠痛阈值的差异，判定药物有无镇痛作用。
1动物 小鼠（18 g～22g），雌性。
2药品 某药，生理盐水。
3器材 热板测痛仪，天平，注射器（1mL 2支），大镊子。
1 调整仪器①接通电源，按动“升温”按钮，将温度设定为53℃～55℃。②测痛记时：按动“T”按钮，计时开始，再次按动“T”按钮，计时停止，并锁定数据。再次按动“T”按钮又从零开始计时，周而复始。
2 小鼠筛选及正常痛阈值的测定 取小鼠数只，依次放在热板上，密切观察，记录痛阈值。凡在30s内不舔后足或逃避者皆弃之不用，将合格的小鼠随机分成两组，每组至少10只，将分组结果列入表内。
3 给药及药后痛阈值的测定第一组小鼠腹腔注射某药（0.1mL/10g），第二组小鼠腹腔注射同容量的生理盐水做对照。给药后30min、45min各测痛阈值一次（如60s内无反应，应将小鼠取出，以免把脚烫伤，痛阈值按60s计算）。将两次测得的平均值作为药后痛阈值（即观察值X）进行t检验。
4 t检验 显著性检验中，两组均数的显著性检验最常用的是t检验。一般分三步：
第一步：检验假设，比较两组均数的差异有无显著性时，首先假设差异是不显著的，即两组平均数无本质区别，差异可能是由抽样误差引起的，这样假设在统计学上称为“无效假设”。
第二步：计算t值，进而求得概率（P值）。
公式：
式中，：均数；
：两组均数的标准误；
Sc2：两组均数的标准差；n：例数；∑：总和；
第三步：判断结果，查“t值表”，t值越大P值越小，但t值的大小又与自由度有关。两样本自由度（n′）：n′＝n1+n2－2
1.镇痛药、解热镇痛药在镇痛作用、镇痛作用原理及临床应用等方面有何不同？
2.影响本实验准确性的主要因素有那些？实验中怎样控制？
2、实验记录 将各组实验结果填入表2内。
3、实验报告 综合全班的实验结果进行t检验，比较某药与生理盐水的镇痛作用有无不同？写出结论。
结合思考题进行讨论。
表2 药物的镇痛作用
未 知 药 组
生 理 盐 水 组
鼠号
药后痛阈值/s
30min 45min
平均值
1
12
2
22
1 因热板法实验的个体差异较大，实验动物均应预先筛选，一般以疼痛反应在30s内为敏感鼠，可供实验用。
2 小鼠应选雌性，因雄性鼠遇热时阴囊松弛，易与热板接触而影响实验结果。
3 按要求使用仪器，不可随意调动，以免损坏仪器。
实验四 药物半数有效量（ED50）的测定
一、实验目的学习改进寇氏法测定药物ED50的方法、步骤、计算过程。
二、实验内容 改进寇氏法测定戊巴比妥钠的半数有效量。动物称重、编号、分组、捉拿、固定、腹腔注射、统计死亡数、计算戊巴比妥钠的半数有效量等。
四、实验准备 预习药物效应与药物剂量的关系，半数有效量的概念、含义，测定药物半数有效量的意义等理论知识。
ED50是标志药物毒性大小的一个参数，它是指在一定的实验条件下，一群动物用药后，约半数动物产生药理效应的剂量。测定ED50的实验方法较多，常用的有：改进寇氏法；序贯法；目测图解法等。
改进寇氏法测定ED50的基本条件和要求：
1 动物多用成熟健康正常的小鼠，雌雄兼用，体重18 g～22g。
2 “反应”应大致呈正态分布，最小剂量组的效应百分率（死亡率）应为0%，最大剂量组的效应百分率（死亡率）应为100%。
3 剂量组必须按等比级数（对数剂量组呈等差级数）分组。
4 动物的给药量应为单位体重给药容量相等。
5 动物分组要随机化，且各剂量组动物数应相等。
1 动物 小鼠（18 g～22g），雌雄各半，每次60只。
2 药品 戊巴比妥钠，苦味酸溶液等。
3 器材 分析天平，鼠笼，粗天平，注射器（1mL），烧杯，量筒，刻度吸管，胶头滴管等。
改进寇氏法。
1设计方案
⑴探索剂量范围 即估计出引起0%及100%有效剂量所在的范围。首先用10倍稀释的一系列药液（5～8组），以20 mL·kg-1的容量各试4只小鼠，找出4/4及0/4有效的剂量组，在此组剂量的基础上进行剂量调整，以2倍稀释的药液每剂量组再试4只鼠，如果某组有效率为4/4，其前一组是2/4或3/4，则可估计该组剂量为100%效应（Dm），如前一组是0/4或1/4、则该组剂量的1.5倍可估计为Dm，同样的方法找出0%效应的量（Dn）。
(2)确定剂量组 即在0%(Dn)～100%(Dm)效应范围内分组，一般以5～8组为宜，各剂量组呈等比级数（比值0.6～0.9），换算成对数剂量后其相邻对数剂量呈等差级数，其差用“i”表示（i须小于0.155），“i”值可按下式计算：
lgDm－lgDn
N－1
lg最大剂量—lg最小剂量
ⅰ= =
N：组数。
⑶配制系列（低比稀释法）药物溶液 按小鼠腹腔注射药物溶液的容量10 mL·kg-1或20 mL·kg-1配制已确定好的各剂量组药物的浓度，作好标记，备用。
2正式实验
取鼠、称重、标号，随机分为已确定好的组数（5组），每剂量组用鼠10～15只，各组动物数应相等。观察正常的活动状态，按已设计好的剂量组，分别腹腔注射10 mL·kg-1，观察睡眠的鼠数，以翻正反射消失达40秒以上为睡眠，记录之并按下式计算：
⑴ED50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]
式中，Xm:最大剂量的对数；
i :对数剂量的组间距离；
P:各剂量组的睡眠率。
⑵95%可信限=ED50±4.5（SlgED50）•ED50
式中，SlgED50: lgED50的标准误；
p：各组睡眠率；
n：各组例数。
表3 戊巴比妥钠ED50测定
组 别
剂 量/mL
对数剂量
实验鼠数
/只
睡眠鼠数
睡眠百分率/%
P
(Dm)
3
5
(Dn)
1、ED50为何指标？ED50的95%可信限的含义？
2、测定ED50有何意义？
2、实验记录 各组动物的给药剂量、对数剂量、睡眠动物数、睡眠率等。
１、表中只给出了Ｄｍ、Ｄｎ，根据要求自己计算出其他各组的剂量（Ｄ）及LogD。
2、ED50的含义，测定ED50的意义？
3、评价药物安全性的指标有哪些？各自的意义？
附录——实验课相关的实验动物基本知识和给药方法
（一）实验动物的基本知识
1 实验动物的选择：实验常用动物有蛙、蟾蜍、小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬和猴等。由于动物的种属、品系、性别等不同，对药物的反应性不同。因此，应根据实验的目的、要求来选择适合的实验动物。例如，测定药物的半数致死量或半数有效量需要动物的数量多，常选用小鼠，因小鼠种系清楚，繁殖快、比较经济。
2 实验动物的编号：犬、家兔等较大的动物可用特制的号码牌固定于耳廓上；小鼠、大鼠等，用黄色苦味酸涂于不同部位标号，如给小鼠标记1~10号，可将小鼠背部的肩、腰、臀部按左、中、右分为九个区，从右到左标记1~9号，10号不做标记（见图1）。
图1动物标号示意图
3 相关实验动物的捉拿、固定方法
（1）小鼠：捉拿时动作要轻，先用右手抓住鼠尾，将小鼠放于鼠笼网上，轻向后拉，以左手的拇指及食指捏其双耳和头颈皮肤，无名指、小指和掌心夹其背部皮肤和尾部，便可将小鼠完全固定。
（2）大鼠：大鼠的牙齿尖锐锋利,捉拿时以右手或持夹子抓住鼠尾，左手戴上防护手套抓紧鼠的双耳和头皮，并将背部皮肤固定于左手中，对于身体特别大或凶狠咬人的大鼠，可先以布巾包裹其身（露出口、鼻）, 然后进行操作。
（3）家兔：捉拿时应一手抓住颈部皮肤，将其提起，另一手托住臀部，使兔呈坐位姿势。家兔的固定方法很多，如做颈胸腹部手术应背位固定于手术台上，四肢用绳索捆紧，头部用固定器固定，如做耳静脉或皮下，肌肉注射，应固定于兔筒进行。
4 相关实验动物的取血方法
（1）小鼠、大鼠取血法
①股静脉或股动脉取血：麻醉动物，背位固定，切开腹股沟皮肤，剥离暴露出股动、静脉，可用针刺入取血或切断放血，大鼠亦可以股动脉插入胶管多次连续放血；350g体重大鼠可采8~10mL；500g体重可采15mL。
②尾尖取血：将小鼠尾部剪掉1~2mm，然后自尾根部向尖端按摩，血即可流出。亦可用刀片交替切割鼠尾三根静脉取血，每次可取0.3~0.5mL，此法可间断取血进行常规检查。
③眼眶后静脉丛取血：固定鼠头部皮肤，轻轻向后压迫颈部两侧，使头部静脉回流受阻，眼球充分外突，用内径1~1.5mm的毛细玻璃管刺入眼睑与眼球之间,轻轻向眼底部方向移动,血即可流入玻璃管内,一般两眼可各取一次。
④断头取血：用剪刀剪断鼠头，立即将鼠颈部向下，提起动物，并对准已准备好的容器，可接所需血液。
（2）家兔取血法
①心脏取血：将家兔背位固定，在胸骨左缘3mm，第3~4肋间隙，触及心跳最明显部位，以8号针头刺入，即可有血自流注射器内，亦可抽取，如没刺入心脏，一定要将针提到皮下改变方向，再重新刺入。
②耳缘静脉取血：将耳根部压紧，拔去耳缘毛，用酒精棉球涂擦使血管扩张明显，以6～7号针头，针尖向离心方向刺入，缓慢抽取血液，也可用刀片从末端处切断，即可取血。
③股静脉、股动脉取血：将家兔麻醉，背位固定，手术分离出股动脉或静脉，插入套管即可根据需要量取血。
5 相关实验动物的处死方法
实验结束后，须将动物处死，方法如下：
①颈椎脱臼法，：此法适用于小鼠，手持镊子或用拇指、食指固定小鼠后头部，捏住鼠尾，用力向后上方牵拉，使之颈椎脱臼死亡。
②心脏取血法：用粗针头刺入心脏一次抽取大量血液，可致动物立即死亡。此法适用于豚鼠、家兔、猴等。
③大量放血法：此法常用于犬、猫等。麻醉犬，可横向切开股三角区，切断股动静脉，血液立即喷出，同时用自来水冲洗出血部位，以免血液凝固。动物可在3~5min内死亡。麻醉猫，可切开颈三角区，分离出动脉，以动脉夹夹住上下两端，插入动脉插管后再松开下方动脉夹，轻压胸部可放大量血液，动物立即死亡。
④空气栓塞法：用注射器将空气迅速注入静脉，可致动物立即死亡。家兔、猫致死空气量为10~20mL，犬为70~150mL。
（二）相关实验动物的给药方法
1 注射给药法
（1）腹腔注射法
①小鼠：以左手抓住小鼠（方法同灌胃）,右手持注射器（宜用5~6号针头），取45°角将针头从下腹部向头端刺入腹腔。进针部位不宜太高，刺入不能太深，防止刺破内脏，注射量为0.1~0.2mL·10g-1体重。
②大鼠、豚鼠、家兔、猫、犬：腹腔注射皆可参照小鼠腹腔注射法。
（4）静脉注射法
家兔：家兔静脉注射一般采用耳缘静脉（耳外缘的血管为静脉，中央的血管为动脉）。将家兔置固定筒内，拔去耳壳外缘毛，用酒精棉球涂擦耳缘静脉部皮肤，使血管充分扩张。用左手拇指和中指捏住兔的耳尖部，食指垫在兔耳注射处下面，右手持带有6号针头的注射器，从耳尖部向心端刺入静脉，以左手使针头和兔耳固定，将药液推入。若有阻力和局部皮肤发白隆起，表示针头在血管外，此时将针头稍退回，再重新穿刺血管，注射完毕，用棉球压住针眼，拔去针头，注射量一般为1.0~2.0mL·kg-1。
