《天然药物化学》
课程编号：1241533027
实验指导书
主撰人 解军波
审核人 李建颖
、
天津商业大学生物技术与食品科学学院
二〇一二年十月
前 言
1．实验总体目标
天然药物是人类防病治病药物的一个重要来源。提取、分离天然药物中具有生理活性的化学成分，是天然药物化学研究的一个重要课题。天然药物化学实验主要是学习天然药物有效成分的提取、分离、纯化、鉴定的方法。通过实验，加深学生对理论知识的深入理解，训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力，为将来从事相关研究打下坚实的实践基础。
⒉ 适用专业年级 制药工程专业三年级（第五学期）
⒊ 先修课程 分析化学、有机化学
⒋实验环境
实验室的噪音、防震、防尘、防腐蚀等方面的环境条件应符合在室内开展的检定项目之检定规程。
5. 实验总体要求
提取、分离、纯化、鉴定是贯穿于天然药物化学实验的全过程的基本操作单元。正确掌握和灵活处理各个环节的操作技能是训练学生严格认真的科学态度与良好工作习惯，促进理论与实践结合的一个重要环节。通过本实验让学生掌握、熟悉天然药物化学提取、分离、鉴识技术的基本原理与基本方法，能够进行日常的天然药物研究工作。
6.本实验的重点、难点及教学方法建议
为了保证实验的正常进行和培养学生良好的实验作风及保证实验质量，学生必须遵守下列要求：
1、实验前必须充分预习实验讲义，明确实验目的、要求，防止实验盲目性，讲求实验质量。
2、实验时要严格按照规范操作进行，仔细观察实验现象，认真记录有关数据。要善于思考，学会运用所学理论知识解释实验现象，研究实验中的问题。
3、重视安全操作，遵守实验室安全守则，使用易燃、易爆、有毒物品时要小心谨慎，避免事故发生。
4、要认真写好实验报告，实验报告要清楚、简练、整洁。
实验一 从三棵针中提取、分离小檗碱与小檗胺
三棵针为小檗属植物，种类繁多，是黄连、黄柏的重要代用品。根中含多种生物碱，有季胺类生物碱，如小檗碱，巴马亭、药根碱、非洲防己碱、木兰花碱；有叔胺碱，如小檗胺，尖刺碱，异粉防己碱等。
小檗碱是一种常用的抗菌药，对菌痢、肠炎、上呼吸道感染等疾病有良好的疗效。小檗胺有升白、降压、利胆及镇咳等作用，对预防和治疗白细胞减少疗效较好。
一、实验目的
l、了解小檗碱，小檗胺的结构与性质，掌握提取分离方法。
2、熟悉小檗碱，小檗胺的鉴识反应及薄层色谱鉴别方法。
二、实验内容
利用溶剂提取法、重结晶等方法从三颗针中提取、分离小檗碱与小檗胺，并采用薄层色谱法进行鉴别。
三、实验要求
以学生自主训练为主的开放模式组织教学，让学生熟悉常见天然药物化学提取分离方法的操作及其注意事项。
四、实验准备
复习天然药物化学中的相关知识，预习相关方法和相关事项。
五、实验原理
l、小檗碱
黄色针晶，能溶于水(1：20)、乙醇(1：100)，易溶于热水及热乙醇，难溶于乙醚、石油醚、苯及氯仿。
2、小檗胺
白色或无色结晶，难溶于水，易溶于乙醇中，可溶于乙醚，氯仿、石油醚。
本实验的提取分离原理是：小檗碱、小檗胺的硫酸盐易溶于水，小檗碱的盐酸盐难溶于水，小檗胺的盐酸盐可溶于水，游离的小檗碱为季胺碱可溶于水，游离的小檗胺是叔胺碱，难溶于水。因此，将植物原料用稀H2SO4溶液浸泡，然后用石灰乳调至pH 12左右，小檗碱游离而溶于水，小檗胺含酚羟基成钙盐也溶于水，粘液质及过量硫酸生成不溶性钙盐而沉淀析出，再加NaCl，并用盐酸调pH 8左右时，小檗碱成难溶性的氯化小檗碱而析出，小檗胺游离析出，最后利用氯化小檗碱在热水中溶解度较大的性质与小碱胺分离。
六、实验条件
旋转蒸发器、真空泵、真空干燥箱、1000毫升三角瓶、烧杯、分液漏斗、烧杯、表面皿
硫酸、乙醇、氯仿、甲醇、盐酸、氢氧化钠、碘化铋钾皆为分析纯，蒸馏水、生石灰、活性炭
三颗针药材 盐酸小檗碱、小檗胺对照品
七、实验步骤
(一)小檗碱与小檗胺的提取分离
取三棵针粗粉100克，置1000毫升三角瓶内，加700毫升0.2％(V／V)的H2SO4溶液，80℃下浸泡2小时，纱布过滤，置滤液于大烧杯内，搅拌下加入石灰乳至pH 12，静置30分钟，抽滤，滤液中加入计算量(8％W／V)的NaCl，静置，滴加浓盐酸，调pH至2，静置盐酸小檗碱沉淀析出，抽滤，60℃以上干燥，即得盐酸小檗碱。
所得滤液滴加10% NaOH调pH至8～8.5，于80℃热水中保温半小时，静置，抽滤，所得沉淀于60℃以下干燥，得小檗胺的粗品。
(二)精制
取小檗胺粗品，置50毫升烧杯中，加20倍量乙醇加热溶解，加入2％活性炭，再加热煮沸5分钟，热过滤，滤液蒸除乙醇，剩l／4量，冷却，滴加蒸馏水至不再析出沉淀为止，用5％NaOH调pH 8-8.5，80℃水浴加热5分钟左右，放置，抽滤，干燥。
(三)薄层色谱鉴别
层析板：硅胶G板，110℃，活化半小时。
展开剂：氯仿-甲醇-氨水(15：2：3滴)
样 品：盐酸小檗碱乙醇液、盐酸小檗碱标准品液、小檗胺乙醇液、小檗胺标准品液
显 色：改良碘化铋钾
八、思考题
1生物碱的纯化方法有哪些？
2生物碱的常用显色方法及试剂有哪些？
九、实验报告
认真写好实验报告，实验报告要清楚、简练、整洁，数据处理符合分析要求。内容包括：实验名称、目的要求、实验原理、仪器与试药、操作步骤、实验结果、讨论。
十、注意事项及其它说明
1、用硫酸浸泡时，硫酸的浓度以0.2％为宜，此时生成的硫酸小檗碱在水中溶解度较大，若加入过量，小檗碱就形成酸式硫酸盐，水中溶解度就降低(1：100)，影响小檗碱的提取量。
2、在pH～8.5时小檗胺沉淀较完全，但不易凝聚，故80℃保温，使凝聚而沉降。
3、小檗碱精制时调pH至2，是为了使小檗胺等叔胺型生物碱留在溶液中除去，以便得到较纯的小檗碱，操作时若溶液己冷却析出结晶，就应加热成澄明溶液再用盐酸调pH2。
实验二 甘草酸的制备与鉴定
1、掌握高速逆流色谱分离纯化的原理
2、熟悉高速逆流色谱、中压制备色谱的操作方法
利用高速逆流色谱等方法制备甘草酸，并采用紫外分光光度法进行鉴别。
以学生自主训练为主的开放模式组织教学，让学生熟悉高速逆流色谱的操作及其注意事项。
1、HSCCC利用了一种特殊的流体动力学(单向流体动力学平衡)现象。其原理是基于样品在旋转螺旋管内的互不混溶的两相溶剂间分配不同而获得分离，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备，并且可以达到几千个理论塔板数。与其他柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。
2、甘草酸：本品为白色粉末，有甜味。分子式及分子量：C42H62O16822.92。熔点220℃,有特殊甜味，溶于热水和热的稀乙醇，不溶于无水乙醇。在254nm处有最大吸收。
TBE-300A型高速逆流色谱仪系统、中压色谱系统、旋转蒸发器、真空泵、真空干燥箱、紫外分光光度计
分液漏斗、烧杯、表面皿
反相硅胶（SP-120-40/60-ODS-B）、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、盐酸、氨水皆为分析纯，蒸馏水、
甘草药材 甘草酸对照品
1甘草酸粗提物的制备：
取甘草药材100g，粉碎，过筛（40目），用95%乙醇（1：4）超声提取三次，每次45分钟。合并提取液减压抽滤，旋转蒸发仪浓缩得褐色浸膏。在浸膏中加2% NaOH溶解，过滤，滤液用2% HCl酸化至不再有沉淀生成，过滤，滤渣用冰水洗涤后用真空干燥器在50℃下干燥，得甘草酸粗品。
2高速逆流色谱分离：
2.1供试液的制备：
精密称取甘草酸粗品100mg，溶解于10ml乙酸乙酯-正丁醇-水（5：1.5：5）上层溶液中。
2.2分离纯化：
将供试液注于色谱仪中，收集相应部位，回收溶剂，得纯度较高的甘草酸。
分离条件如下：固定相 乙酸乙酯-正丁醇-水（5：1.5：5）（氨水适量）
流动相 乙酸乙酯-正丁醇-水（5：1.5：5）（氨水适量）
流速 1.5ml/min 转速 1000rpm
温度 25℃ 检测波长254nm
3中压色谱分离：
3.1 装柱 取反相硅胶500g,于105℃活化2h后，取出放置室温即可装柱。柱子采用干法填充，填满整个柱体，不留死体积。
3.2 分离 取第3步所得甘草酸，取10ml丙酮溶解，上样，泵人中压柱柱头，以甲醇-水（50：50），25ml／min的流速进行洗脱，254nm波长检测，收集相应部位，真空干燥，得甘草酸纯品。
4测定紫外图谱，鉴定。
1高速逆流色谱选用分离溶剂体系的原则是什么？
2天然产物的纯度测定常用的方法有哪些？
注意仪器的安全操作
