《药物分析》
课程编号：1241532008
实验指导书
主撰人 解军波
审核人 李建颖
天津商业大学生物技术与食品科学学院
二〇一二年十月
前 言
1．实验总体目标
药物分析是一门研究与发展药物质量控制的方法学科，是整个药学领域中一个重要的组成部分。其目的在于通过本课程的教学，使学生树立全面控制药物质量的观念，理解药物的化学结构与药物质量控制之间的关系，掌握常用的药物分析方法，最终培养学生的独立工作的能力。
药物分析实验是为药物分析理论课程服务而设，其目的是在理论联系实际的基础上，增强学生动手技能，提高学生分析问题、解决问题的能力，适应现代社会对药学人才的要求。
⒉ 适用专业年级 制药工程专业四年级（第七学期）
⒊ 先修课程 药物化学、天然药物化学、分析化学、仪器分析
⒋ 实验环境
实验室的噪音、防震、防尘、防腐蚀等方面的环境条件应符合在室内开展的检定项目之检定规程。
5. 实验总体要求 掌握药物及其制剂分析技术的基本原理与基本方法，能够进行日常的药品质量检验工作。熟悉分析方法的建立及各项效能指标的评价。了解药品应该检测与控制的质量指标，在制订和完善药品质量标准上具有一定的理论知识和实际工作能力。
6. 本实验的重点、难点及教学方法建议
(1)做好预习，明确每次实验的目的要求，弄懂原理和操作要点，预先安排好实验进程，估计实验中可能发生的问题及处理方法。每次实验课均应有准备地接受教师的提问。
(2)严格按照实验规程操作，虚心接受教师的指导，认真掌握操作技术，细心观察实验现象，进行讲义内容以外的实验或重做实验需得到老师的批准。
(3)防止试剂、药品污染，取用时应仔细观察标签和取用工具上的标志，杜绝错盖瓶盖或不随手加盖的现象发生。如不慎发生试剂污染时，必须及时报告老师。公用试剂、药品应在指定位置取用。此外，取出的试剂药品绝不可倒回原瓶。
(4)爱护仪器，小心使用。破损仪器应及时登记报损、补发。使用精密仪器需经老师同意，用后登记签名。
(5)实验时确保安全，时刻注意防火、防爆。发现事故苗头及时报告，不懂时不要擅自动手处理。
(6)清洁液一般仅限于洗涤滴定管、吸量管、容量瓶等。使用时应先用水冲洗仪器，沥至无滴水后，用清洁液浸洗；其他玻璃仪器一般用洗涤剂或去污粉刷洗。注意节约蒸馏水，清洗玻璃仪器应遵守少量多次的原则。
(7)爱护公物，节约水电、药品和试剂。可回收利用的废溶剂回收至指定的容器中。不可任意弃去。腐蚀性残液应倒入废液缸中，切勿倒进水槽。
(8)实验完毕后应认真清理实验台，仪器洗净后放回原处，擦净台面，晾好抹布、毛刷、放好凳子、锁好柜子，经教师同意后方可离开。值日生应负责整理公用试剂台、打扫地面卫生、清除垃圾及废液缸中污物，并检查水、电、门窗等安全事项。
(9)认真总结实验结果，按指定格式填写实验报告，并按规定时间交出。
实验一 复方对乙酰氨基酚片的含量测定
一、实验目的
1掌握亚硝酸钠滴定法测定胺类药物含量的基本原理
2熟悉复方制剂含量测定的特点
二、实验内容
利用亚硝酸钠滴定法测定复方对乙酰氨基酚中对乙酰氨基酚的含量。
三、实验要求
以学生自主训练为主的开放模式组织教学，让学生复习熟练滴定方法的操作及其注意事项。
四、实验准备
复习分析化学中相关滴定的知识与概念，滴定操作的相关步骤和相关事项，预习亚硝酸钠滴定法的原理和操作注意事项。
五、实验原理、方法和手段
复方对乙酰氨基酚片由对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸、咖啡因三种药物组成，根据其结构的不同，可通过亚硝酸钠滴定法测定对乙酰氨基酚的含量。
第一步：水解，得到芳香伯胺
+ CH3COOH
OH
N. Cl-
N+
NH2
第二步：重氮化定量反应：
+ NaCl +2 H2O
六、实验条件
1恒温水浴锅、酸式滴定管、碱式滴定管、三角瓶
2氯仿、乙醇、酚酞指示剂、0.1mol/L氢氧化钠液；稀硫酸、溴化钾、含锌碘化钾淀粉指示液、0.1mol/L亚硝酸钠液
3复方对乙酰氨基酚片（市售品）
七、实验步骤
精密称取上述细粉适量，（约相当于对乙酰氨基酚0.3g），加稀硫酸40mL，附回流冷凝管，加热回流1小时，冷却。
加水50mL、盐酸20mL、溴化钾3g，将滴定管的尖端插入液面下约2/3处，用0.1mol/L亚硝酸钠液迅速滴定，随滴随搅拌。
至近终点时，将滴定管的尖端提出液面，用少量水将尖端洗涤，洗液并入溶液中，继续缓缓滴定，至用细玻璃棒蘸取溶液少许，划过涂有含锌碘化钾淀粉指示液的白瓷板上，即显蓝色条痕，停止滴定，5分钟后，再蘸取溶液少许划过一次，如仍显蓝色条痕，即为终点，即得。
每1mL亚硝酸钠液（0.1mol/L）相当于15.12mg的对乙酰氨基酚（C8H9NO2）。
八、思考题
1在滴定过程中，加入溴化钾的目的是什么，为什么滴定管的尖端要插到液面以下三分之二处？
2锌碘化钾淀粉指示液的原理是什么，本实验还可采用哪种终点指示方法？
九、实验报告
认真写好实验报告，实验报告要清楚、简练、整洁，数据处理符合分析要求。内容包括：实验名称、目的要求、实验原理、仪器与试药、操作步骤、实验结果、讨论。
计算标示量百分数。
十、注意事项及其它说明
无
实验二 中药制剂的显微定性鉴别
1、熟悉中药制剂的常规分析方法——显微鉴别方法。
2、熟悉中成药分析的理化定性方法。
利用显微镜鉴别牛黄解毒片和银翘解毒片
以学生自主训练为主的开放模式组织教学，让学生熟悉显微镜鉴别方法的操作及其注意事项。
复习生药学中相关中药鉴定的相关知识，温习显微镜的使用方法和相关事项。
中药的显微鉴别是利用显微镜来观察中药制剂中保留有原药材的组织、细胞或内含物等显微特征，从而鉴别制剂的处方组成。本法操作简便、准确可靠，耗费少。为《中国药典》收载的鉴别中药制剂的常用方法。
1.生物显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、乳钵、擦镜纸、小镊子、小刀。
2 水合氯醛试液、甘油醋酸试液、稀甘油（AR）。
3.牛黄解毒片、银翘解毒片（市售品）。
（一）牛黄解毒片显微鉴别（牛黄、雄黄、石膏、大黄、黄芩、桔梗、冰片、甘草）
操作方法：取本品片心，研成粉末，取少许，置载玻片上，滴加适量水合氯醛试液，加热透化后加稀甘油1滴，盖上盖玻片，用吸水纸吸干周围透出液，置显微镜下观察。
1.草酸钙簇晶大，直径60~140µm。
2.不规则碎块金黄色或橙黄色，有光泽。
（二）银翘解毒片显微鉴别（金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、牛蒡子、桔梗、淡竹叶、甘草）
操作方法：取本品粉末少许置载玻片上，用水合氯醛试液装片，透化后加稀甘油1滴，盖上盖玻片，置显微镜下观察：
1.花粉粒黄色，类球形，直径54~68µm，有三孔沟；表面具细密短刺及圆粒状皱纹。
2.草酸钙簇晶成片，直径5~17µm，存在于薄壁细胞中。
1.试述你观察到的显微特征，各代表何种中药材。
2.通过对以上中成药的显微鉴别，请你总结出中成药的显微鉴别的方法及注意事项。
透化过程中注意酒精灯的安全操作。
实验三 中药制剂的理化定性鉴别
1 .掌握TLC的鉴别方法。
2.熟悉中成药分析的理化定性方法。
利用理化鉴别方法复方丹参片、银黄口服液、板蓝根颗粒剂，利用TLC法鉴别牛黄解毒片。
以学生自主训练为主的开放模式组织教学，让学生熟悉常见理化鉴别鉴别方法和TLC的操作及其注意事项。
复习天然药物化学中的相关知识，预习TLC方法和相关事项。
利用中药中化学成分的理化性质，采用一定的试验方法鉴别鉴别制剂的处方组成，为《中国药典》收载的鉴别中药制剂的常用方法。利用薄层层析原理，分离检测中药中的特定成分，采用相应对照品，比较供试品相应的色谱行为，进行鉴别。
1.双槽层析缸、三用紫外分析仪、紫外分光光度计、分析天平（0.01mｇ）、超声波清洗仪、铺板器、薄层色谱仪、薄层喷雾泵、喷雾瓶与喷雾架、2μL、5μL定量点样毛细管
2.硅胶G、玻璃板10cm×20cm、分析玻璃柱、聚酰胺。
3.胆酸对照品、（中国药品生物制品检定所）。
4.复方丹参片、银黄口服液、板蓝根颗粒剂、牛黄解毒片（市售）。
5.其他试剂均为分析纯。
（一）化学定性鉴别
1.复方丹参片
取本品1片，研细，进行微量升华，所得白色升华物，加新制的1%香草醛硫酸溶液1~2滴，液滴边缘渐显玫瑰红色。
2.银黄口服液本品为金银花提取物、黄芩提取物经加工制成的口服液。
（1）取本品1mL，加5%硝酸钠溶液和10%硝酸铝溶液各0.3mL，生成黄色沉淀，再加氢氧化钠试液使成碱性，沉淀即溶解，溶液显棕红色。
（2）取本品0.1mL，加水10mL摇匀，取溶液2mL，加5%二氯氧化锆1~2滴，溶液显黄色，再加盐酸溶液1~2滴，黄色不褪。
3.板蓝根颗粒剂
（1）取本品0.5ｇ，加5mL甲醇使溶解，静置，取上清液点于滤纸上，晾干，置紫外光灯（365nm）下观察，显蓝紫色。
（2）取本品0.5ｇ，加10mL甲醇使溶解，静置，滤过，取滤液1mL，加茚三酮试液0.5mL，置水浴中加热数分钟，显蓝紫色。
（二）牛黄解毒片的薄层色谱鉴别
1、供试品溶液制备：取本品10片，精密称定，粉碎，精密称取药粉适量（约3片），置量瓶中，精密加乙醇10mL超声30分钟，补重，过滤，作为供试品溶液。
2、对照品溶液制备：取大黄素对照品，精密称定，加乙醇制成每1mL中含1mｇ的溶液，作为对照品溶液。
3、点样与展开：精密吸取上述对照品溶液各5、10μL，供试品溶液20μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯-醋酸-甲醇（20∶25∶2∶3）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
1.定性鉴别实验中每一部分实验原理分别是什么？
2.TLC分析原理是什么？是鉴别处方中何种中药材？
注意酒精灯的安全操作
实验四 薄层色谱法测定中药制剂中成分的含量
1．熟悉TLCS法测定中药制剂的成分的基本方法。
2了解TLCS的基本原理。
利用薄层色谱法测定牛黄解毒片中胆酸的含量。
以学生自主训练为主的开放模式组织教学，让学生熟悉TLCS的操作及其注意事项。
复习仪器分析中的相关知识，预习TLCS方法和相关事项。
薄层扫描法是用一定波长的光照射在薄层板上,对薄层色谱有紫外光和可见光吸收的斑点,或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描,将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、检查和含量测定的方法。牛黄解毒片中含有牛黄，对该制剂的含量测定可以测定其中胆酸的含量。
1恒温水浴锅、索氏提取器、超声波提取器、分析天平、定量毛细管、三用紫外分析仪
2薄层涂布器、薄层展开缸、玻璃层析柱（15cm*1cm）、电吹风
3薄层层析用硅胶G、其它试剂均为分析纯
（1）供试品溶液制备：（同实验三）
（2）对照品溶液制备：（同实验三）
（3）点样与展开：（同实验三）
（4）TLCS含量测定并计算：检测波长365nm
什么是外标两点法，它与外标一点法相比的优缺点是什么？
注意仪器软件的操作步骤
实验五 牛黄解毒片中黄芩苷的含量测定
1.掌握中药制剂中黄芩苷的含量测定方法。
2.熟悉高效液相色谱仪的使用方法。
利用高效液相色谱法测定牛黄解毒片中黄芩苷的含量。
以学生自主训练为主的开放模式组织教学，让学生熟悉高效液相色谱的操作及其注意事项。
复习仪器分析中的相关知识，复习高效液相色谱方法和相关事项。
利用高效液相色谱法分离牛黄解毒片中黄芩苷，在λman315 nm处进行检测。为了减小实验条件波动对分析结果的影响，采用随行外标一点法定量。
1.高效液相色谱仪、超声波提取器、分析天平。
2.甲醇（色谱纯）、磷酸（AR）、双蒸水、乙醇（AR）。
3.黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所）。
4.牛黄解毒片（市售品）。
1.对照溶液制备 精密称取在60℃减压干燥4小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成1mL中含30μｇ的溶液，即得。
2.供试品溶液制备 取本品20片，（包衣片除去包衣），精密称定，研细，混匀，取约1ｇ，精密称定，加70%乙醇30mL，超声处理20分钟，放冷，滤过，滤液置50mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，溶液滤入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀，即得。
3.测定法
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水-磷酸（45∶55∶0.2）为流动相；检测波长为315nm。
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
1. HPLC中常用的定量方法有几种？外标一点法有何特点？
2.牛黄解毒片中黄芩苷的含量测定还可用哪些方法？
实验六 丹参葡萄糖注射液的HPLC指纹图谱
的初步识别与建立
1熟悉中药HPLC指纹图谱建立的方法与步骤
2了解中药指纹图谱建立的意义
利用高效液相色谱法初步建立丹参葡萄糖注射液的指纹图谱。
以学生自主训练为主的开放模式组织教学，让学生熟悉中药指纹图谱建立的基本知识及其注意事项。
复习仪器分析中的相关知识，预习指纹图谱方法和相关事项。
中药指纹图谱，是指某种（或某产地）中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其特性的光谱或色谱图。
中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段，它建立在中药系统研究的基础之上，主要用于鉴别真伪和评价原药材、半成品及制剂质量的均一性和稳定性，基本属性是“整体性”和“模糊性”。
中药化学成分的多样性与复杂性是其治疗的物质基础，同时也是质量评价的重点和难点。在现有的研究手段和条件下，由于中医药理论与现代医学的差异，使得阐明中药的有效成分进而控制中药质量成为一项极为困难的研究课题，近几年来，指纹图谱的研究已经逐渐成为研究中药质量控制手段的重要方向之一。建立中药指纹图谱能针对中药多成分、多途径、多靶点作用特点，较为全面地反映中药中所含内在化学成分的种类与数量，进而有效地表征其质量，对中药材，中药制剂的规范化生产，对进一步研究中药的作用机理、物质基础和量效关系，提高其质量都具有重要的意义。
1高效液相色谱仪、二极管阵列检测器、色谱工作站
2超声波清洗仪、过滤装置
3甲醇、乙睛为色谱纯，重蒸水，其它试剂均为分析纯
4原儿茶醛对照品
5丹参葡萄糖注射液（市售）
1供试品溶液的制备 取市售丹参葡萄糖注射液，冰箱中4℃保存，备用。
2对照品溶液的制备 由于丹参葡萄糖注射液中原儿茶醛和丹参素为主要成分，在HPLC分析中，二组分峰面积在指纹图谱中所占的比例较大且较为稳定，可选之为对照品。准确称取原儿茶醛2mg，用流动相定容至5mL，备用。
3测定条件的选择：
（1） 流动相的选择：预先设定三种流动相系统（甲醇-水系统、乙睛-水系统、甲醇-0.1%冰醋酸系统）进行实验，并适当调节流动相比例，保证谱图中各色谱峰分离较好，保留时间适中，在比较三种系统分离效果的基础上，确定最佳流动相条件。
（2）检测波长的选择：实验中通过二极管阵列检测器，分别比较在210nm、254nm、280nm、325nm的色谱图，根据色谱峰的个数，及各峰之间的分离度情况，确定最佳的检测波长。
（3）其它条件：柱温定为30℃，流速为1mL/min。
4测定方法：分别取各批注射液供式样品10μL进样，按上述条件记录各色谱峰的保留时间和积分面积（每批供试样品重复2次）。
5方法学考察：（了解）
（1）精密度实验：取同一份样品，连续进样5次，计算各色谱峰的相对保留时间与相对峰面积（以原儿茶醛为参照），RSD%不得大于3%。
（2）重复性实验：取同一批样品，制备5份，按上述方法测定，计算各色谱峰的相对保留时间与相对峰面积（以原儿茶醛为参照），RSD%不得大于3%。
（3）稳定性实验：取同一份样品，分别在0小时、1小时、2小时、4小时、8小时进行测定，计算各色谱峰的相对保留时间与相对峰面积（以原儿茶醛为参照），确定供试品溶液的稳定性。
6丹参葡萄糖注射液HPLC指纹图谱及技术参数的确定及处理（了解）
（1）指纹图谱及共有指纹峰的标定：根据5批供试品HPLC图谱所给出的相关参数，确定供试品的所有成分色谱峰的完全出峰时间。比较各批样品的色谱图，确定各批样品的共有峰。
（2）共有指纹峰面积：以原儿茶醛为参照，计算各指纹峰的相对保留时间和相对积分面积。
（3）非共有峰面积：非共有峰面积占总峰面积应小于5%。
中药指纹图谱建立的意义及目前存在的问题是什么？
